GENÉTICA MOLECULAR DE LA HEMOFILIA

GENÉTICA MOLECULAR DE LA HEMOFILIA


Director: Dr. Carlos De Brasi
Investigador Independiente CONICET
cdebrasi@hematologia.anm.edu.ar
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INTEGRANTES:

• Dra. Liliana Rossetti. Inv. Adjunta CONICET
• Dra. Pamela Radic. Inv. Asistente CONICET.Dir.Dr. De Brasi
• Dr. Martín Abelleyro. Bec. Post-Doctoral IMEX-ANM. Dir. Dr. De Brasi
• Dra. VaninaMarchione. Bec. Post-Doctoral CONICET – Dir. Dr.De Brasi, Co.Dir. Dra. Rossetti.
• Lic. Karen Waisman. Bec. Doctoral ANPCyT. Dir. Dr. De Brasi, Co.Dir.Dr. Abelleyro.
• Lic. BetianaZiegler. Bec. Doctoral CONICET.Dir. Dr. De Brasi, Co.Dir.Dra. Radic.


OBJETIVOS ACTUALES DEL LABORATORIO

El objetivo general de nuestro Laboratorio es investigar toda la diversidad cualitativa y cuantitativa de las relaciones entre el genotipo y el fenotipo hemofílico en varones y mujeres.
El diagnóstico molecular de grandes rearreglos genómicos (y en particular las inversiones mediadas por palíndromos genéticos) no ha sido satisfactoriamente resuelto en la práctica y ni aún con el uso de técnicas de análisis masivo del genoma. En este escenario, incluidos en el objetivo general, también estamos abocados a desarrollar nuevos abordajes para la detección masiva, y específica de estos grandes rearreglos mediado por duplicones, investigar sus mecanismos y explorar su evolución molecular en el genoma humano.

LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN

Línea 1
Relaciones Genotipo-Fenotipo en Hemofilia e inhibidor.
Genotype-phenotype relationships in Haemophilia and inhibitor.
Marchione VD, Radic CP, De Brasi CD, Rossetti LC.
Factores genéticos y no genéticos que condicionan el desarrollo de anticuerpo inhibidor de la terapia sustitutiva en Hemofilia. Como paradigma de enfermedades monogénicas, en hemofilia A y B (HA y HB) el fenotipo hemofílico está mayormente determinado por el genotipo del F8 y F9, respectivamente. Sin embargo, el desarrollo de anticuerpos neutralizantes de la terapia con FVIII (o FIX) en HA (o HB) (inhibidor), constituye un rasgo complejo, multifactorial o multigénico involucrando típicamente numerosos factores genéticos y también factores ambientales. El principal factor que predispone al desarrollo de inhibidor en Hemofilia es la mutación causal. Aplicando el algoritmo para el estudio del F8 y F9 en HA y HB, respectivamente, se han realizado estudios tipo caso/control para estimar los riesgos relativos a desarrollar inhibidor. Asimismo, trabajando con poblaciones estratificadas por la mutación causal (e.g., inversión del intrón 22 del F8, Inv22, involucrada en el 45% de los pacientes con HA severa) abordamos el estudio de otros factores genéticos o no genéticos secundarios o que confieren potencialmente una predisposición más débil a desarrollar inhibidor (e.g., polimorfismos asociados a expresión diferencial en los genes IL10, TNFA, CTLA4 y otros).

Línea 2

Expresión de Hemofilia en mujeres portadoras. Inactivación sesgada del cromosoma X.
Haemophilia expression in carrierfemales. X chromosome inactivation skewing.
Ziegler B, Rossetti LC, De Brasi CD, Radic CP.
Caracterización molecular de mujeres con Hemofilia: inactivación del cromosoma X en portadoras heterocigotas, y niveles de actividad del FVIII. Como enfermedad ligada al cromosoma X y recesiva, la hemofilia se manifiesta en el varón hemicigota pero no en mujeres heterocigotas. Sin embargo, existen algunos (muy pocos) casos reportados de mujeres con hemofilia como consecuencia de la interacción de la inactivación sesgada extrema del cromosoma X sobre el alelo normal en portadoras heterocigotas; o más raramente aún, en mujeres homocigotas (por unión consanguínea) o doble heterocigotas (por concurrencia de dos mutaciones distintas). Entre las muchas portadoras diagnosticadas, se destacan casos de mujeres con expresión clínica de HA severa (FVIII:C< 1 IU/dl). Se ha observado principalmente en portadoras heterocigotas la presencia de inactivación sesgada extrema del X (X-inactivationpattern, XIP > 90%), mediante el sistema sensible a metilación del gen AR (Xq) y RP2 (Xp). Asimismo, se están investigando las posibles causas de la inactivación sesgada en estudios de tipo caso/control, enfocándose en polimorfismos tipo SNPs en o vecino a los genes del centro de inactivación del cromosoma X (XIC) (e.g., genes no codificantes JPX, FTX, y XIST).

Línea 3

Rearreglos genómicos del cromosoma X: lecciones de la Hemofilia humana.
X chromosome genomic rearrangements: lessons from human Haemophilia.
Waisman K-Abelleyro MM, Marchione VD, Radic CP, Rossetti LC, De Brasi CD.
Debido a su ubicación en el cromosoma X, las grandes deleciones del F8 y F9 pueden detectarse por ausencia consistente de señales específicas en los varones hemicigotas. La amplificación específica de sus puntos de ruptura permite la caracterización detallada de las secuencias vecinas potencialmente involucradas en el evento original. Con estos datos es posible aportar a una colección de rearreglos genómicos llamativamente escasa de casos caracterizados en la literatura y permite el análisis bioninformático teórico de los mecanismos involucrados. Entre los mecanismos que han sido asociados al origen de los rearreglos causales de hemofilia (grandes deleciones) están todos los descriptos en la literatura hasta el presente, Este “muestrario” exhaustivo de mecanismos incluye: los asociados a la replicación del DNA, Microhomologymediated break inducedrepair (MMBIR) y Forkstalling and templateswitching (FoSTeS), y los asociados a meiosis, Non homologousendjoining (NHEJ) y Non allelichomologousrecombination (NAHR) mediada por duplicones (secuencias repetidas). Asimismo, en este tópico se incluye el análisis de la Inv22, la definición y genotipificación de todos sus tipos (1 y 2) y variantes (1v y 2v) y todos los rearreglos mediados por los homólogos int22h, como las duplicaciones (i.e., Dup22) y la deleciones (i.e., Del22) involucrando 0.5Mb de DNA genómico en Xq28 incluyendo más de 6 genes de importancia médica además del F8.

Línea 4

Diseño y desarrollo de herramientas moleculares de diagnóstico genético.
Design and development of molecular tools for gene testing.
Abelleyro MM, Waisman K, Marchione VD, Radic CP, Rossetti LC, De Brasi CD.
Nuestro Laboratorio ha tenido desde el inicio de sus actividades la vocación de diseñar, desarrollar y validar nuevas técnicas de análisis genético costo-efectivas de baja o mediana complejidad para su aplicación en países con economías con recursos limitados. Para mencionar sólo un ejemplo, en 2005, nosotros desarrollamos un nuevo abordaje para detectar la Inv22 por medio de la técnica de inverseshifting -PCR (IS-PCR) (Rossetti et al, ClinChem 2005) que más tarde fue modificada para abarcar la genotipificación de todos los rearreglos de los duplicones int22h (Inv22, Del22 y Dup22) e int1h (inversión del intrón 1, Inv1) (Rossetti et al, J Thromb Haemost 2008), las técnicas actualmente más usadas internacionalmente. En esta línea también hemos desarrollado una nueva adaptación de la técnica de IS-PCR para abarcar la clasificación correcta de las nuevas variantes de la Inv22 (Inv22-1v e Inv22-2v).
Asimismo, desarrollamos un nuevo abordaje para el diagnóstico de eventuales deleciones en el F8 y F9 en heterocigosis mediante un sistema de medición relativa de dosis génica involucrando un amplímero en la región blanco en alguna región del F8 o F9 en el cromosoma X y una región de referencia en el gen CTLA4 en el cromosoma 2, y una población control de doble dosis, mujeres (46,XX) y varones (46,XY) como control de simple dosis (deleciónheterocigota).
La determinación haplotípica de pares de marcadores genéticos (e.g., STRs, SNPs, RFLPs) se realiza por análisis genético de ligamiento en el árbol familiar, o, físicamente, mediante PCR directa alelo-específica, lo que presenta limitaciones relativas al tamaño de amplificación. Debido a que a veces no se cuenta con antecedentes familiares para realizar el análisis de ligamiento, o que no se puede realizar la determinación física pues los marcadores no pueden ser detectados por PCR directa, hemos diseñado un nuevo abordaje para realizar el diagnóstico directo de la fase haplotípica entre la Inv22 y un STR (CA)n ubicado en el F8-IVS21 mediante la aplicación de la técnica de phasingbyinverse-PCR (PIP), abordaje que combina la amplificación por PCR inversa alelo-específica y PCR anidada.
En el presente nuestro Laboratorio está abocado a desarrollar un método sencillo y directo para mapear las estructura del genoma y sus potenciales variantes (rearreglos asociados o noCNVs, asociados o no a NAHR entre duplicones) mediante la aplicación de secuenciación masiva paralela (MPS) sobre círculos de restricción (fragmentos de restricción circularizados de DNA) y análisis procesamiento bioinformático. Nuestro desarrollo Piloto está centrado en el estudio del F8 y la elusiva Inv22.


PUBLICACIONES

PUBLICACIONES EN MEDIOS DE DIFUSIÓN Y REVISTAS NO INDEXADAS

  1. De Brasi CD (2011). Introducción a la Genética Molecular de la Hemofilia. Hematología 1.14 CLAHT.pdf. Grupo CLAHT Web page: pp 1-21. Jul 2011:http://ebookbrowse.com/introd-genet-molec-hemofil-claht-pdf-d230288268).